Nature Communications 14권, 기사 번호: 2018(2023) 이 기사 인용
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줄기 세포를 지지하는 틈새 내의 노화 관련 결함은 줄기 세포 활동의 노화 관련 감소에 기여합니다. 그러나 연령 관련 틈새 결함의 기본 메커니즘과 틈새 기능 복원이 줄기 세포 적합성을 향상시킬 수 있는지 여부는 아직 불분명합니다. 여기에서 우리는 골수(BM) 내의 지지 틈새를 젊어지게 함으로써 노화된 혈액 줄기 세포 기능이 회복될 수 있는지 확인하고자 했습니다. 우리는 Netrin-1을 BM 틈새 세포 노화의 중요한 조절자로 식별합니다. Netrin-1의 틈새 특이적 삭제는 BM 미세 환경 내에서 조기 노화 표현형을 유도하는 반면, 늙은 쥐에 Netrin-1을 보충하면 노화된 틈새 세포를 젊어지게 하고 노화된 혈액 줄기 세포의 경쟁력을 젊은 수준으로 회복시킵니다. 우리는 Netrin-1이 활성 DNA 손상 반응(DDR)을 유지하는 데 필수적인 역할을 하며 틈새 유래 Netrin-1의 노화 관련 감소가 BM 미세 환경 내에 DNA 손상 축적을 초래한다는 것을 보여줍니다. 우리는 Netrin-1 보충이 DNA 손상을 해결하고 노화된 BM 틈새 및 혈액 줄기 세포의 재생 잠재력을 복원하여 일련의 화학 요법을 견디기에 충분하다는 것을 보여줍니다.
노화는 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 치료가 자주 필요한 혈액학적 악성 종양의 위험 증가와 관련이 있습니다. HSCT에 필수적인 골수억제를 달성하기 위한 감소된 강도 조절(RIC) 요법은 노인 환자의 HSCT에 대한 적격성을 크게 확장했으며 현재 동종 HSCT의 ~39% 및 자가 HSCT의 ~55%가 60세 이상의 성인에서 수행되는 것으로 추정됩니다. 나이1,2. RIC 요법은 이식 관련 사망률(TRM)을 감소시키지만 재발 위험 증가와 관련이 있습니다2. 반대로, 무병 생존율을 향상시키는 고강도 컨디셔닝 요법은 노인 환자의 TRM 증가와 관련이 있습니다. 노인 환자가 조혈모세포이식 음성 결과/실패의 위험이 더 높은 주요 원인 중 하나는 노화가 골수억제의 세포독성 부작용을 회복하는 조혈계의 재생 능력을 감소시키는 것입니다. 이는 부분적으로 체력 및 기능 장애로 인해 발생합니다. HSC를 지지하는 골수(BM) 틈새3,4,5,6. HSC 체력을 유지하는 데 틈새 세포가 수행하는 중요한 역할은 잘 확립되어 있지만 HSC 지원 틈새 활동4,8에서 연령 관련 악화의 기본 메커니즘에 대한 통찰력은 거의 없습니다.
노화 동안 틈새 기능과 HSC 적합성을 향상시킬 수 있는 후보 요인을 식별하기 위해 우리는 조혈 시스템9의 조기 노화를 나타내는 최근에 설명된 쥐 모델의 전사체 데이터를 조사했습니다. 우리의 분석은 BM 틈새시장의 노화를 조절하는 데 있어 Netrin-1(NTN1)의 추정 역할을 밝혀냈습니다. NTN1은 최근 혈관 신생 및 골형성을 포함한 다양한 과정을 조절하는 것으로 밝혀진 확립된 축삭 안내 신호로, 이는 NTN1이 잠재적으로 BM 틈새 활동을 조절할 수 있음을 시사합니다. 조혈 시스템에서 NTN1은 최근 HSC의 Neogenin-1(NEO1)에 대한 리간드로 확인되었으며 BM 틈새 유래 NTN1이 HSC의 NEO1과 결합하여 어린 쥐의 HSC 휴면성을 보존한다고 제안되었습니다. 그러나 NTN1이 BM 틈새 기능을 조절하는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 여기서 우리는 NTN1을 항상성, 재생 및 노화 동안 틈새 세포 적합성의 중요한 조절자로 식별합니다. 우리는 BM 중간엽 간질 세포(MSC)와 BM 내피 세포(BMEC)를 BM 내의 틈새 유래 NTN1의 중요한 소스로 정의하고 NTN1이 틈새 HSC와 틈새 틈새 상호 작용을 모두 조절한다는 것을 입증합니다. Leptin Receptor+ (LepR+) MSC 또는 어린 생쥐의 EC에서 NTN1의 조건부 삭제는 BM 틈새 및 조혈 시스템에 기능적 결함을 유발합니다. 우리는 틈새 세포와 HSC가 활성 DNA 손상 반응(DDR)을 유지하고 DNA 손상 발생을 방지하며 노화 중 기능적 잠재력을 보존하기 위해 NTN1이 필요하다는 것을 보여줍니다. 우리는 완충된 DDR이 EC, MSC 및 HSC 노화의 기본적으로 보존된 특성임을 확인하고 NTN1 보충이 완충된 DDR을 재활성화하고 틈새 세포 및 HSC 내에서 발생한 DNA 손상을 해결한다는 것을 입증합니다. 우리는 재조합 NTN1로 노화된 쥐를 치료하는 것이 BM 혈관 완전성 개선 및 노화 관련 BM 비만 억제를 포함하여 노화된 BM 혈관 틈새의 표현형 결함을 역전시키는 데 충분하다는 것을 보여줍니다. 또한 우리는 NTN1 매개 틈새 회춘이 노화된 HSC의 자가 재생 능력을 젊은 수준으로 복원하는 것과 관련이 있음을 입증합니다. 노화된 조혈 시스템에 대한 NTN1의 유익한 효과는 조혈 회복 가속화, 생존율 증가 및 연속 골수억제 화학요법 동안 체중 보존으로 해석됩니다. 요약하면, 우리의 연구 결과는 NTN1 보충이 노화된 BM 혈관 틈새의 완전성을 강화하고, 노화된 HSC의 기능적 잠재력을 회복하며, 노인 환자의 골수 억제 요법에 따른 생존율을 향상시키는 치료 전략으로 작용할 수 있음을 나타냅니다.
6 months post-transplant) HSC engraftment potential d without lineage alterations e in HSCs derived from LepR-NTN1 mice (N = 6 donors/group; N = 18 Recipients for Control donors, N = 14 Recipients for LepR-NTN1 donors). f RT-qPCR analysis of FACS purified LepR+ MSCs demonstrating decreased NTN1 expression in LepR-NTN1 mice (N = 3 mice/group). g–i BM analysis of CDH5-NTN1 mice demonstrating no gross changes in BM cellularity g, and HSC frequency h, i, as compared to littermate controls (N = 5/group). j, k Competitive HSC transplantations (250 CD45.2+ donor HSCs with 106 CD45.1 WBM competitor/recipient) demonstrating a loss of long-term engraftment potential j, along with a myeloid-biased output k, in HSCs derived from CDH5-NTN1 mice (N = 6 donors/group; N = 14 recipients/group). l RT-qPCR analysis of FACS purified BMECs demonstrating decreased NTN1 expression in CDH5-NTN1 mice (N = 3 mice/group). Error bars represent sample mean ± standard error of the mean (SEM). Statistical significance determined using two-tailed unpaired t-test. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. ns denotes statistically not significant./p>1% CD45.2+ engraftment) 16 weeks following transplantation (Fig. 8b, c). To evaluate HSC fitness, we performed competitive HSC transplantations utilizing donor HSCs derived from aged mice treated with NTN1 or vehicle (PBS). 2500 HSCs (CD45.2+) were FACS purified from each donor (N = 10 PBS-treated and N = 10 NTN1-treated aged mice), and were competitively transplanted into 5 recipient (CD45.1+) mice (500 CD45.2+ HSCs with 1.5 × 106 CD45.1+ WBM competitor per recipient; a total of 50 recipients for each treatment group). Simultaneously, HSCs derived from N = 12 young (3 month-old, CD45.2+) mice were pooled and transplanted into 20 recipients (500 CD45.2+ HSCs with 1.5 × 106 CD45.1+ WBM competitor per recipient), and served as young controls for comparison. As expected, HSCs from PBS-treated aged mice demonstrated the hallmark characteristics of an aged HSC including diminished long-term engraftment along with altered lineage reconstitution including increased myeloid-skewing and decreased T cell reconstitution, as compared to HSCs derived from young controls (Fig. 8d, e). Remarkably, HSCs derived from NTN1-treated aged mice exhibited long-term engraftment and balanced lineage reconstitution indistinguishable from young controls (Fig. 8d, e). To assess whether NTN1 restores self-renewal potential of aged HSCs, we performed secondary transplantation assays utilizing WBM derived from primary recipients, which revealed that hematopoietic cells derived from NTN1-treated aged mice robustly maintain their long-term engraftment (~ 75% of young HSC engraftment levels), and exhibit balanced multilineage reconstitution equivalent to young HSCs (Fig. 8f, g). On the other hand, lineage analysis of hematopoietic cells derived from PBS-treated aged mice demonstrated significantly higher variance in lineage reconstitution with a near complete loss of myeloid or lymphoid output in a subset of recipients that reflect an exhaustion of HSC functional potential (Fig. 8g)./p>4 months) HSC engraftment potential d and myeloid-biased output e, similar to HSCs from young donors (N = 10 donors/group; Recipients N = 20 (Young), N = 44 (Aged-PBS), N = 48 (Aged-NTN1)). f, g Secondary transplantation demonstrating a preservation of serial repopulation f and balanced lineage reconstitution abilities g in donor cells derived from NTN1 treated aged mice (N = 10 donors/group; Recipients N = 10 (Young), N = 20 (Aged-PBS), N = 16 (Aged-NTN1)). h Experimental design describing HSC transplantation strategy to assess the direct effects of NTN1 treatment on aged HSC function (Supplementary Fig. 4d). Following an 11 day ex vivo expansion, 10,000 FACS sorted expansion cells (DAPI-CD45.2+) from each donor were transplanted along with 106 WBM competitor cells (CD45.1) into preconditioned CD45.1 recipients. Following long-term (>6 month) engraftment, CD45.2+ HSCs were FACS purified from primary recipients, and transplanted along with fresh CD45.1 WBM competitor cells into preconditioned CD45.1 secondary recipients. i Bar graphs demonstrating long-term engraftment potential in ex vivo cultured aged HSCs, as compared to HSCs derived from young mice. Note that NTN1 treatment restores LTMR ability of aged HSCs (N = 2 donors/group; Recipients N = 18 (Young), N = 20 (Aged-PBS), N = 19 (Aged-NTN1)). j Bar graphs demonstrating serial repopulation and LTMR (>4 months) (Recipients N = 12 (Young), N = 20 (Aged-NTN1)). Data is presented as the mean ± standard error of the mean (SEM). Statistical significance determined using two-tailed unpaired t-test (for pairwise comparisons), and One-Way ANOVA with Tukey’s correction for multiple comparisons. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. ns denotes statistically not significant./p>6 month) engraftment ability (Fig. 8h, i). While expansion cells derived from PBS-treated aged HSCs manifested a complete loss of long-term engraftment potential, aged HSCs cultured in the presence of NTN1 demonstrated robust long-term engraftment and balanced multi-lineage reconstitution, outperforming expansion cells derived from young HSCs (Fig. 8i). To test the self-renewal ability of expanded HSCs, we performed secondary transplantation assays (Fig. 8h, j) utilizing FACS sorted HSCs from primary donors (CD45.2+), and transplanting them into secondary recipients (CD45.1+), along with freshly isolated WBM competitor cells (1000 CD45.2+ HSC plus 1 × 106 CD45.1 WBM competitor per recipient). While HSCs derived from both young control and NTN1 treated aged primary donors displayed similar levels of long-term (>4 months) engraftment, HSCs derived from NTN1 treated aged mice had more recipients with long term multilineage reconstitution (LTMR), while maintaining balanced lineage reconstitution when compared to young controls (Fig. 8j). Taken together, these data suggest that direct effects of NTN1 on aged HSCs are sufficient to rejuvenate their self-renewal potential to youthful levels./p>13) for 1 hour at 4 °C, following which electrophoresis was performed in 850 mL chilled alkaline electrophoresis solution (200 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH>13) at 21 V constant voltage for 30 minutes. Slides were sequentially washed in water and 70% ethanol, air dried, and counterstained with SYBR Gold (ThermoFisher Scientific) solution as per manufacturer’s recommendations. Images were acquired on a Ti2 epifluorescence microscope (Nikon). Image analysis was performed utilizing the CometAssay® Analysis Software with default parameters, and all identified comets were manually reviewed for accuracy./p>2N DNA)./p>2N DNA)./p> 1.25 and False Discovery Rate (FDR) < 0.1. For HSC RNA-Seq analysis (N = 3 Samples per group, N = 3 Groups), genes with low expression values were filtered out with a more stringent cut-off (FPKM < 1 in 3 samples), owing to smaller number of samples per group, with default settings for normalization. Heatmaps depicting unsupervised hierarchical clustering of the Top 100 differentially expressed genes were generated with default parameters. For pairwise comparisons (Young vs Aged PBS and Aged PBS vs Aged NTN1), similar FPKM cutoffs (FPKM < 1 in 3 samples) was utilized to filter out low-abundant genes, and the processed datasets (N = 12717 genes for Young vs Aged PBS, N = 12256 genes for Aged PBS vs Aged NTN1) that passed filter were downloaded and utilized for GSEA./p>
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